Juan Diego Flórez nació en Lima, el 13 de enero de 1973. Es hijo del cantante y guitarrista de música criolla peruana Rubén Flórez, acompañante de la célebre cantautora Chabuca Granda y de María Teresa Salom.

Estando en el cuarto año de educación secundaria conoció al profesor de música Genaro Chumpitazi Guerero, quien le dio sus primeras clases de impostación vocal y lo hizo cantar como solista del colegio en concursos escolares y en presentaciones de Zarzuelas con sus compañeros de promoción y lo hizo ingresar al Conservatorio Nacional de Música (Lima) a inicios del año 1990.

Su voz, casi educada para el canto lírico, surgió en el curso de sus estudios con el maestro Andrés Santa María. Durante este tiempo, fue miembro del Coro Nacional del Perú y cantó como solista en la Misa de la Coronación de Mozart y en la Petite Messe Solennelle de Gioacchino Rossini.

Ingresó al Instituto Curtis de Filadelfia, Estados Unidos, donde estudió entre 1993 y 1996, y comenzó a cantar en producciones de ópera estudiantiles en el repertorio por el cual es conocido hoy, Rossini y óperas del Bel canto de Vincenzo Bellini y Gaetano Donizetti. También estudió con Marilyn Horne en el Santa Barbara Academy Summer School de California. En 1994, el tenor también peruano, Ernesto Palacio, lo invitó a Italia, a participar en una grabación de la ópera de Vicente Martín y Soler, Il Tutore Burlato, y se hizo subsecuentemente maestro y mentor de Flórez.

La primera gran sensación y debut profesional de Flórez llegó con el Rossini Festival de Pesaro en 1996. Con 23 años, inicialmente iba a participar en un rol menor en Ricciardo e Zoraide y en el coro de otras, pero dejó las filas del coro para tomar el reemplazo del papel del tenor principal de Corradino en Matilde de Shabran, pues el tenor principal, Bruce Ford, estaba enfermo. Su presentación causó sensación y luego otra vez más en similares circunstancias reemplazando a Giuseppe Sabbatini. Ese mismo año hizo su debut en la Teatro de La Scala de Milán como el Cavaliere danese en Armide de Christoph Willibald Gluck. Luego siguió su debut en el Royal Opera House, Covent Garden en 1997 donde cantó el rol del Conde Potoski en una versión de concierto (y la primera moderna) de Elisabetta de Donizetti. Siguieron su debut en la Ópera Estatal de Viena en 2000 como Rinuccio en Gianni Schicchi y en la Ópera del Metropolitan en el 2002 como el Conde de Almaviva en El Barbero de Sevilla.

Ha sido premiado con el Premio Abbiati 2000 (dado por los críticos italianos al mejor cantante del año), el Rossini d'oro, el Bellini d'oro, el Premio Aureliano Pertile, el Premio Tamagno y el Premio L'Opera award (Migliore Tenore) por su actuación del 2001 de La Sonnambula en La Scala.
Firmó por Decca en 2001 y desde entonces ha lanzado cuatro CDs de recitales solistas en el sello Decca: Rossini arias que ganó el Cannes
Classical Award de 2003, Una Furtiva Lagrima, ganó el Cannes Classical Award de 2004, Great Tenor Arias (2005) y Sentimiento Latino (2006), un recital con temas clásicos de la música popular latinoamericana. Los CDs han encontrado críticas positivas que ensalzan su técnica. El más común agasajo acerca de su canto es su caracterización individual total de cada rol que toma. Admira a Alfredo Kraus.

En octubre de 2003 Pavarotti declaró que el peruano Juan Diego Flórez podría ser sucesor como cantante de ópera. Si bien Luciano Pavarotti le mencionó como su sucesor, tanto la crítica como el mismo Flórez han declarado que, mientras Pavarotti fue un tenor lírico, Flórez es lírico-ligero, por lo que sus repertorios difieren.
En julio de 2005 participo en los megaconciertos de Live 8 en Berlín, siendo el único peruano en participar en dicho megaevento. El 2 de junio de 2007 Flórez cantó junto al cantante popular también peruano Gianmarco Zignago en Lima.

El 3 de junio El presidente Alan García Pérez distinguió con la Orden El Sol en el Grado de Gran Cruz a Juan Diego Flórez, por su destacada participación en el mundo de la lírica. El peruano de renombre mundial recibió la condecoración en nombre de los jóvenes que luchan por hacer realidad sus sueños, por creer en sí mismos y pensar que lo pueden lograr en un país como el Perú.
El 30 de marzo de 2008 debutó la Ópera Rigoletto en el Teatro Municipal del Callao. Floréz interpretó al Duque de Mantua, uno de los papeles más emblemáticos del repertorio operístico, en el que grandes cantantes como Alfredo Kraus o Carlo Bergonzi dejaron en su día interpretaciones de referencia para la historia.

El 8 de abril del 2008, el cantante español de ópera Plácido Domingo declaró su admiración por el peruano Juan Diego Flórez, al que consideró en Madrid como "el más grande tenor ligero de todos los tiempos". "Es el más grande tenor de todos los tiempos, el máximo de su categoría. No me acuerdo de otro que haya cantado así ese repertorio tan difícil que él interpreta", manifestó Domingo, "cuando Juan Diego te canta con res bemoles y naturales, son verdaderos, no de falsete, verdaderos agudos", destacó el tenor español.